在進行限制性酶切反應過程中，影響限制性酶切反應效果的因素較多，要設計酶切反應，一般均應考慮諸如酶切系統、溫度條件、反應體積、底物性質及星型反應等因素。根據各種不同的條件，酶切反應的設計一般應注意以下問題：
         1. 大多數限制酶貯存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結冰。當*終反應液中甘油濃度大于12％時，某些限制酶的識別特異性降低，從而產生星活性，更高濃度的甘油會抑制酶活性。因此加入反應的酶體積不超過反應總體積的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影響。
         2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋，但切勿用水稀釋以免酶失活，用水稀釋的酶不能長期保存。
         3. 反應體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子，當用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時，酶活性會被抑制，或改變酶的特異性，導致星型反應。
         4. 多種因素可引發星型反應：①非*適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機溶劑的存在。
         5. 反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴散，并降低酶活性。建議酶切反應的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。
         6. 酶切反應所加入的酶量應適中，根據底物的種類、量的多少和體積的大小而定，對不同的限制酶，各廠家均有一的消化量指標可參考。
         7. 當要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：
         ①先用在低離子強度的緩沖液中活性高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶，繼續反應；
         ②使用能夠使多數內切酶均表現較高活性的單種緩沖液。
          8. 用同一種酶切割不同的DNA時，所需酶量不同，可根據DNA底物上酶切位點的多少與λDNA存在位點的數目比較后，決定用酶量。對于超螺旋DNA，基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA，使用的酶單位活性應適當加大。
         9. 反應混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩定性。
        10.酶切底物DNA應具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會不同程度地影響限制酶的活性。
        11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個重要因素，所以轉化實驗所選擇的受體菌株應考慮到使用的菌株中的酶修飾系統。
       12.要保證酶作用時的*佳反應條件（ph, 溫度）和底物用量，酶反應才能有效地進行。
       13.反應取酶時應使用無菌吸頭，以免污染酶液，同時應盡量縮短酶在溫室的放置時間。
       14.高于37℃或需長時間保溫時，可加入礦物油覆蓋在反應液上以減少水分蒸發。
       15.反應混合物混勻時，應避免強烈振蕩以保證不使內切酶變性及DNA大分子的完整。
       16.反應前的低速離心是必要的，這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
       17.用已硅化的離心管進行酶切反應，可獲得更佳的酶切效果，否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。
       18.終止酶反應可根據需要采用不同的方法：①酶切后不需進行下一步反應，可加入含EDTA的終止液終止反應；②若需進一步反應（如連接，切割等），可將反應管置65℃保溫20-30分鐘，以滅活酶終止反應。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀獲得較純DNA進行下一步酶學操作。
       19. 不同廠家的試劑不可混用，需要時請查明相關條件及數據。
二、限制性酶解中常見的問題及解決措施：
       限制性酶切割DNA底物的操作過程中，會出現一些問題，產生的原因主要為酶解體系中各要素處于非*佳狀態，包括DNA的純度和特性，反應緩沖液、反應體積、反應時間及溫度等。

酶切反應的注意點：

   1  20ul體系是*佳體系

   2  20ul體系*多切2ug的DNA

   3  甘油的量是低于體系的5%，不超過10%

   4  酶切效率和酶的質量，保護堿基，酶切位點的位置（同一段DNA不同位置可以差很遠，就算是都在中間也是一樣的），酶切位點狀態（如位點及周圍幾個堿基是否被甲基化等，有些甲基化后切不開，有些恰好相反。DAN的空間結構、識別序列的側翼序列、DNA來源也有影響）酶的量，DNA的量，體系的純凈度（比如雜質的干擾，很多雜質如乙醇等可以明顯抑制酶活性,另外還有DNase，蛋白質，EDTA，SDS，鹽離子，酚氯仿），buffer的選擇，是否加BSA,DNA 的狀態（比如超螺旋狀態DNA酶切效率低5倍－－這也是不能1ug質粒用1u酶切的原因，也不能只切1h的原因），星號活力等（也是因為雜質干擾或者甘油太多，buffer不合適，酶活性不穩定）

   5  一般不好的酶需要8倍的酶量，切2－4h。如果是比較好的酶可以4倍酶量切2－4h，甚至可以一倍酶量切10h以上。 做的不好的酶一來有雜質酶污染，切久了污染的酶產生的影響會很明顯，相對的酶量用大些引起的雜質酶切割問題要小些，所以采用大酶量短時間。 二來不好的酶不穩定，時間長了識別位點會發生變化，造成亂切的情況。所以采用了大酶量短時間的方法，雖然有些浪費。 而比較好的酶則相反。

注意酶加BSA目的一可以穩定酶，低濃度酶容易降解。二可以減少管臂對酶非特異吸附。

用孵箱不要用水浴箱，因為國產貨不穩一不小心就39去了，對酶活性殺傷較大，孵箱至少不會突然很熱了。hk1933.com

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